3种方法检测白假丝酵母菌对氟康唑、伏立康唑的敏感性对比

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陈文伟 黄良珍 彭钢文 临床研究 作者单位：528400 广东中山，中山市古镇人民医院检验科 通讯作者：陈文伟，Email：401753338@qq.com DOI：10.3969/j.issn.1674-7151.2016.04.004

【摘要】

目的 比较抗真菌药敏试验纸片扩散法、ATB FUNGUS3（ATB F3）微量稀释法和E-试验 （Epsilometer test）检测白假丝酵母菌对氟康唑、伏立康唑的结果，探讨 3 种方法的可比性和一致性。

方法 使用纸片扩散法和 ATB F3 法对中山市古镇人民医院住院患者分离的 58 株白假丝酵母菌进行 药敏试验，同时用 E- 试验作为对照。

结果 纸片扩散法与 E- 试验的符合率在氟康唑为 69.0%（40/58）， 在伏立康唑为 98.2%（57/58）；ATB F3 法与 E- 试验的符合率在：氟康唑为 89.7%（52/58），在伏立康唑 为 96.6%（56/58）。

结论 纸片扩散法检测白假丝酵母菌对氟康唑敏感性与 E- 试验符合率不甚理想， ATB F3 法比较理想；而伏立康唑无论纸片法还是 ATB F3 法与 E- 试验结果符合率非常一致。ATB F3 法检测白假丝酵母菌敏感性操作简便，使用成本低，大多数医院特别是基层医院应该推广普及。

【关键词】 ATB FUNGUS3；E- 试验；抗真菌药敏试验

虽然真菌感染是机会性感染性疾病，但威胁人 类生命的真菌感染每年都在不断地增多，其中念珠 菌感染占了很大一部分比例［1］，并已成为医院重症 加强治疗病房（ICU）最严重的感染源之一［2］。由于广谱抗菌药物的长期和大量使用、血液透析及肿 瘤化疗药物的使用，静脉导管的介入治疗及细胞免 疫低下的人群不断增多，导致真菌败血症的发病率逐渐增高［3］，国外有报道器官移植的患者念珠菌感 染达到了 3.5%［4］，对肝移植术后患者应注意预防 真菌感染［5］。氟康唑、伏立康唑均为临床上应用 的比较多的抗真菌药物，随着抗真菌药物的使用增 多，耐药率也在不断地上升［6-7］，其中白假丝酵母菌在人体分离的念珠菌中占的比例达到了 55.9%［8］ ，因此，其药敏测试也显得十分重要。本研究将纸片扩散法、ATB FUNGUS3（ATB F3）法和 E- 试验 （Epsilometer test）检测白假丝酵母菌对氟康唑、伏立康唑敏感性结果进行对比分析，报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源  2015 年 1 月至 8 月，从中山市古镇人民医院各临床科室住院患者的痰液、血液、中段尿及伤口分泌物等标本中分离出的白假丝酵母菌 58 株（剔除同一患者同一部位连续分离的菌株，其 中呼吸内科 20 株、骨科 6 株、普外科 5 株、重症监护室 18 株、心肾神经内科 9 株）用于测试药敏试验。

1.2 分离与鉴定  酵母菌分离采用沙保氏琼脂平 板 28℃培养 48 h；鉴定采用法国生物梅里埃公司生产的 API Candida 鉴定分离菌株。

1.3 抗真菌药敏试剂

1.3.1 药敏纸片  由英国 Oxoid 公司生产。氟康唑每片 25 μg，伏立康唑每片 1 μg。

1.3.2 ATB F3 试剂盒   由法国生物梅里埃公司生 产。抗菌药物浓度：氟康唑 1～128 mg/L、伏立康唑 0.06～8 mg/L。

1.3.3 E- 试验试纸条   由瑞典 AB-Biodisk 公司 生产，氟康唑 0.016～256 mg/L、伏立康唑 0.016～ 256 mg/L。药敏培养基成分：RPMI 1640（由广州迪景公司生产），0.165mol/L MOPS（由美国 sigma 公司 生产），1.5%BACTO 琼脂（由美国 DIFCO 公司生产）， 2% 葡萄糖 121℃、15 min，制成直径 150 mm 的平板。

1.4 方法

1.4.1 纸片扩散法    将调好的 0.5 mU 白假丝酵母 菌纯菌液用棉拭子均匀徒布于改良 SHADOMY 琼 脂平板，将相应纸片贴于平板培养 18～24 h 后读结 果，若菌落生长不良则再多培养 24 h，在约 80% 抑 制区判读氟康唑的抑菌直径，在 100% 抑制区读取 伏立康唑的抑菌直径。

1.4.2 ATB F3 法    将调好的 2 mU 白假丝酵母菌纯 菌液 20 μL 加入 ATB F3 培养基中混匀，再从每孔吸取 135 μL 混有菌液的培养基加入药敏板中，置 30℃ 孵育 24～48 h。以生长对照孔生长良好，而含药最 高稀释孔不生长者为最小抑菌浓度（MIC）的终点。

1.4.3 E- 试验    将试验菌株用沙保氏琼脂平板纯化， 挑起菌落溶于生理盐水中，制备成浊度为 0.5 mU 的菌悬液。用无菌棉拭蘸取菌悬液，均匀涂布于药敏专用培养基上，平板干燥 15 min 后将 2 种 E- 试验 试纸条紧贴附于培养基上，30℃下培养 24 h，在抑菌环与纸条上药物浓度交界处下方读取 MIC 值。

1.5 判断标准

1.5.1 纸片扩散法 参照临床和实验室标准协会 （CLSI）M51-A 抗真菌药敏试验标准。氟康唑：培养 18～24 h，抑菌环直径≥19 mm 为敏感，15～18 mm 为中介，≤14 mm 为耐药。伏立康唑：培养 18～24 h， 抑菌环直径≥17 mm 为敏感，14～16 mm 为中介， ≤13 mm 为耐药。

1.5.2 ATB F3 法 参照 CLSI M38-A2 抗真菌药敏试验标准：氟康唑≤8 mg/L、伏立康唑≤1 mg/L 为敏感；氟康唑 MIC≥64 mg/L、伏立康唑 MIC≥4 mg/L 为耐药；氟康唑MIC 在 16～32 mg/L、伏立康唑MIC 在＝2 mg/L 为剂量依赖敏感或中介。

1.5.3 E- 试验 参照 CLSI M38-A2 抗真菌药敏试验标准：氟康唑≤8 mg/L、伏立康唑≤1 mg/L 为敏感；氟康唑 MIC≥64 mg/L、伏立康唑 MIC≥4 mg/L 为耐药；氟康唑 MIC 在 16～32 mg/L、伏立康唑 MIC 在＝2 mg/L 为剂量依赖敏感或中介。

1.6 质量控制   

试验以白假丝酵母菌 ATCC90028 为对照同时进行测定。

2 结果

2.1 质控纸片扩散法

白假丝酵母菌 ATCC90028 对 氟康唑和伏立康唑的抑菌环直径为 23 mm 和 22 mm 均为敏感，质控范围来源于 Oxoid 公司提供的 说明书。ATB F3 法与 E- 试验检测白假丝酵母菌 ATCC90028 对氟康唑的 MIC 分别为 2 mg/L 和 1 mg/L， 对伏立康唑的 MIC 分别为 0.125 mg/L 和 0.125 mg/L。

2.2.1 纸片扩散法与    E- 试验检测白假丝酵母菌对 氟康唑和伏立康唑的敏感性比较 纸片扩散法检测 58 株白假丝酵母菌，对氟康唑的敏感性敏感（S）为 55.2%、依赖（SDD）为 31.0%、耐药（R）为 13.8%； E- 试验 S 为 86.2%、SDD 为 10.4%、R 为 3.4%；对 伏立康唑的敏感性 S 为 91.3%、SDD 为 5.2%、R 为 3.4%；E- 试验 S 为 89.7%、SDD 为 6.9%、，R 为 3.4%。 纸片扩散法与 E- 试验药敏结果符合率在氟康唑 为 69.0%（40/58）；在不符合的 18 株中，6 株纸片 扩散法为 SDD、E- 试验为 S，6 株纸片扩散法为 R、 E- 试验为 SDD。纸片扩散法与 E- 试验药敏结果符 合率在伏立康唑 98.2%（57/58）；在不符合的 1 株中， 纸片扩散法为 S，E- 试验为 SDD。见表 1。

2.2.2 ATB F3 法与 E- 试验检测白假丝酵母菌对氟康唑和伏立康唑的敏感性比较     ATB F3 法检测 58 株白假丝酵母菌对氟康唑的敏感性 S 为 75.9%、 SDD 为 17.2%、R 为 6.9%；E- 试验 S 为 86.2%、SDD为 10.4%、R 为 3.4%；ATB F3 法对伏立康唑的敏感 性为 S 为 93.1%、SDD 为 5.2%、R 为 1.7%；ATB F3 法 与 E- 试 验 药 敏 结 果 符 合 率 在 氟 康 唑 为 89.7% （52/58）；在不符合的 6 株中，2 株 ATB F3 法为 R、 E-试验为SDD；4株ATB F3法为SDD、E-试验为S。 伏立康唑符合率 96.6%（56/58），在不符合的 2 株中 ATB F3 法为 S、E- 试验为 SDD。见表 2。

为 10.4%、R 为 3.4%；ATB F3 法对伏立康唑的敏感 性为 S 为 93.1%、SDD 为 5.2%、R 为 1.7%；ATB F3 法 与 E- 试 验 药 敏 结 果 符 合 率 在 氟 康 唑 为 89.7% （52/58）；在不符合的 6 株中，2 株 ATB F3 法为 R、 E-试验为SDD；4株ATB F3法为SDD、E-试验为S。 伏立康唑符合率 96.6%（56/58），在不符合的 2 株中 ATB F3 法为 S、E- 试验为 SDD。见表 2。

3 讨论

氟康唑属于三唑类抗真菌药物具有广谱的抗菌活性，毒性低，既可口服又可注射，适用于老人和儿童，是治疗深部真菌感染的首选药物。但随着氟康唑使用增多的同时耐药率也上升，新一代三唑类广谱抗真菌药物伏立康唑已经上市。目前在全世界 范围的念珠菌耐药的报道也在不断地增多，当中不乏报道有伏立康唑的耐药。我国学者的研究表明， 假丝酵母菌对氟康唑的耐药在 3.3%~42.3%［9］； Cuenca-Estrella 等［10］在西班牙当地医院分离的 4226 株白假丝酵母菌对伏立康唑的耐药率为 5%， 而伏立康唑在国内耐药则较少报道。本试验结果显示，氟康唑对白假丝酵母菌敏感性纸片扩散法 为 55.2%，ATB F3 法 75.9%，参考对照 E- 试验为 86.2%，纸片扩散法与 ATB F3 法差异有统计学意义 （P < 0.05），伏立康唑纸片扩散法和 ATB F3 法敏感 性超过 90%，差异无统计学意义（P > 0.05）。  

目前，我国纸片扩散法、E- 试验念珠菌的药敏 试验所用标准是 CLSI 2010 年的 CLSI M51-A［11］， 微量稀释法采用的标准是 CLSI M38-A2［12］，其中 CLSI 纸片扩散法操作简便，但本试验显示，纸片扩散法测试氟康唑的敏感性与 E- 试验相比符合率不 甚理想，而测试伏立康唑则与 E- 试验非常一致。 ATB F3 法操作简单、判读方便，成本相对较低，严格 按照操作规程操作即可得到合适浓度范围内的 MIC值，所以 ATB F3 法目前是我国应用最广的念珠菌 药敏测试的方法。但使用 ATB F3 法必须注意两点： ① ATB F3 法试剂板上抗菌药物浓度稀释孔孔数比 较少，由此得出的 MIC 值不如 E- 试验准确，因而其 检测 MIC 折点值有一定误差，对于区分 SDD 株和 R 株存在不足。② 在机器自动判读白假丝酵母菌的 氟康唑和伏立康唑 MIC 折点值，如果存在拖尾现象 时会将 S 或 SDD 读成 R，建议用人工肉眼判读［13］。 E- 试验目前是最佳的测试念珠菌药敏的方法，它结 合了扩散法的原理和特点，与肉汤稀释法和微量稀 释法有良好的符合率［14］，判断 MIC 折点值较准确， 但试纸条价格昂贵，目前临床应用受限而更多地用 于科研。综上所述，大多数医院应该普及 ATB F3 法 测试白假丝酵母菌敏感性，当实验室得出的药敏结 果与临床不符合或治疗效果不佳时，有条件的实验 室应用 E- 试验复检，更好地指导临床用药。