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伏立康唑是新一代三唑类抗真菌药物，其抗菌谱广，抗菌作用强，越来越多的用于曲霉菌、新型隐球菌、念珠菌等真菌感染的治疗，被各大指南推荐作为侵袭性曲霉菌病的首选药物。伏立康唑的疗效、不良反应与血药浓度相关，研究[1-3]表明，食物、年龄均可影响其血药浓度，且伏立康唑治疗窗较窄，药物暴露量与CYP2C19的基因多态性具有显著相关性，又与多种药物之间存在相互作用，这些都可影响其疗效和安全性。伏立康唑具有非线性动力学特征，同一剂量下患者的血药浓度会有不同，因此对其实施血药浓度监测具有重要意义。近年来，多个指南均推荐对伏立康唑进行血药浓度监测，以达到临床安全有效的目的，基于此，我们建立了运用反相高效液相色谱法测定血清中伏立康唑药物浓度，对我院2017年7月–2019年11月血液科460例住院患者的611个标本进行了伏立康唑血药浓度的监测和分析，旨为临床安全合理用药提供参考。 1 仪器与试剂 1.1仪器 LC-2030液相色谱仪（日本岛津仪器公司），Inertsil ODS-3色谱柱（日本GL Sciences公司），MX-S旋涡混合器[大龙兴创实验室仪器（北京）有限公司]，MiniSpin离心机（德国Eppendorf公司），KH5200PV型超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司），电子分析天平（十万分之一）（德国Sartorius公司），Milli-Q Advantage A10超纯水机（德国默克密理博公司）。 1.2试剂 伏立康唑对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100862-201402）；酮康唑对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100294-201203）；甲醇和乙腈（色谱纯，Fisher公司）；冰醋酸为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）；三乙胺为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）。空白血清由唐都医院输血科提供。 2 方法与结果 2.1色谱条件 色谱柱Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈:冰醋酸-三乙胺缓冲液=45∶55（v/v），流速1.0 mL·min-1；进样量20μL；室温25℃；紫外检测波长255 nm。 2.2标准溶液和内标溶液的配置 2.2.1伏立康唑标准溶液的配制 精密称定伏立康唑标准品77.59 mg，以甲醇定容至50 mL容量瓶中，储备液于4℃保存备用。 2.2.2内标溶液的配制 精密称定酮康唑对照品107.61 mg，以甲醇定容至50 mL容量瓶中，储备液于4℃保存备用。 2.3血清样品处理方法 取血清450μL，加入不同浓度的伏立康唑工作液30μL和内标溶液20μL，漩涡30 s混匀，加入乙腈溶液500μL，漩涡3 min，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液20μL进样。 2.4方法学验证 2.4.1专属性考察 患者血清按照“2.3”项下方法进行预处理，进样得色谱图。伏立康唑和血清杂质及内标之间分离良好。详见图1。
2.4.2标准曲线线性关系考察 取空白血清450μL，共7份，分别加入不同浓度的伏立康唑标准溶液，使伏立康唑的药物浓度分别为0.097、0.58、1.46、2.93、5.85、11.69、23.38μg·mL-1，按“2.3”项下方法处理。按照“2.1”项下方法测定。测定结果以伏立康唑浓度（X）为横坐标，伏立康唑与内标峰面积的比值（Y）为纵坐标，用最小二乘法作线性回归，得到血清中伏立康唑浓度回归方程：Y=0.029 5 X–0.003 8，r=0.999 0。血清中伏立康唑在0.097~23.380μg·mL-1的浓度范围内呈良好的线性关系。 2.4.3回收率试验 取浓度分别为0.58、5.85、23.38μg·mL-1伏立康唑工作液各5个样品。按“2.3”项下方法处理后进样分析。取含量相同的伏立康唑工作液直接进样分析，计算伏立康唑在血清中的提取回收率，用回归方程计算方法回收率，详见表1。
2.4.4精密度试验 配制上述回收率考察试验中的3个浓度伏立康唑血清样品，分别在同日内不同时间点和不同日处理后进样分析，计算日内精密度和日间精密度，低、中、高三个浓度的日内和日间精密度分别为0.89%~4.47%和0.72%~4.22%。 2.4.5稳定性试验 1）血清样本室温放置稳定性：配制伏立康唑浓度分别为0.58、5.85、23.38μg·mL-1血清样品，于室温下放置，分别在配制后的2、4、6、8 h处理后进样分析。伏立康唑低、中、高三种浓度血清样本，室温放置稳定性的RSD为0.96%~1.22%。2）血清样本冻融稳定性：配制伏立康唑浓度分别为0.58、5.85、23.38μg·mL-1血清样品，于–20℃冰箱冰冻保存，分别在第0、3、7、14 d解冻测定，考察伏立康唑低、中、高3种浓度血清样品，冻融稳定性的RSD为1.16%~8.42%。 2.4.6重复性考察 取低、中、高三个浓度血清样品，按“2.3”项下方法平行处理后分别连续进样分析5次。结果显示伏立康唑和酮康唑峰面积比值的RSD为0.12%~8.37%。 2.5血液肿瘤患者伏立康唑血药浓度测定结果 应用上述方法对2017年7月–2019年11月在我院血液科住院的460例患者的611个标本进行了伏立康唑血药浓度测定。460例患者中男性比例为55.65%，女性比例为44.35%，临床诊断包括急慢性淋巴细胞白血病、急慢性粒细胞白血病、多发性骨髓瘤以及再生障碍性贫血。给药方式包括口服（164例次）和静脉滴注（447例次），所有用药均用于预防或治疗肺部真菌感染，药物未区分生产厂家。相关指南[4]指出，监测稳态谷浓度具有良好的临床意义，伏立康唑给予负荷剂量时第3天达稳态血药浓度，未给予负荷剂量的则在第5~7天达稳态血药浓度。本实验所有标本均严格按照要求，在血药浓度达稳态后的第一次给药前30 min内采集，本监测结果表明血药浓度能够达到指南推荐的1.0~5.5μg·mL-1的患者比例为67.10%（表2）；男性血药浓度与女性相比相差不大（表3，P>0.05）；大于60岁老年患者血药浓度总体水平较高（表4），这可能与老年人代谢缓慢有关；口服给药和静脉给药血药浓度有显著性差异，静脉给药血药浓度总体水平较高（表5，P<0.01）。
3 讨论 目前，国内外进行伏立康唑血药浓度监测的方法有超高液相、串联质谱、固相萃取-HPLC法、酶免疫放大法等[5-9]，超高液相以及串联质谱的速度、灵敏度和分离度都较高，非常适合复杂组分及微量元素的测定，但这两种仪器的固定资产投入较大，不利于临床推广；固相萃取技术作为样品前处理方法，已普遍应用于实验中，能有效的将标的物质与杂质分离，但该法相对于蛋白沉淀法耗时过长。以服务临床为目的，不仅要做到高效、准确，还要做到快速和便于推广，故本研究选择了高效液相色谱法。 在方法学建立过程中，笔者比较了应用甲醇沉淀蛋白、乙腈沉淀蛋白的提取方法，乙腈沉淀蛋白处理的组织样品无杂质，药物提取回收率高。此外还考察了血清与血浆中内源性物质对伏立康唑浓度监测的影响，发现血浆样品中内源性物质对伏立康唑有明显干扰，导致二者分离度差，所以采用血清样本进行测定。 伏立康唑的分子结构中含有三唑环、吡啶环等碱性基团，在流动相中加入一定比例的三乙胺，不仅可以调节流动相的pH值，还可作为扫尾剂，防止色谱峰的拖尾，改善峰形[10]。 本研究所测定的患者血样为血液肿瘤患者样本，此类患者用药最突出的特点就是合并用药多，采用本研究建立的方法分离度好，能够很好的排除合并用药的干扰，使得目标药物与内标的分离度良好。因此本研究建立的方法具有实用性强、操作简便、数据准确、灵敏度高、重复性好的特点，可作为伏立康唑血药浓度日常监测方法，为临床合理安全用药提供有力的保障。目前国内外研究结果表明，伏立康唑药动学个体差异大，且临床疗效和不良反应与血药浓度显著相关[11-17]，故指南建议，在给药4~7 d后应监测伏立康唑血药谷浓度，以指导剂量调整，使谷浓度水平达到有效治疗范围[17]，根据国外指南推荐伏立康唑可能的安全浓度范围为1.0~5.5μg·mL-1，研究表明，当谷浓度高于1μg·mL-1时，疗效增加，当谷浓度≥4μg·mL-1，神经毒性增加，谷浓度≥5μg·mL-1，肝毒性增加，因此谷浓度范围在1.0~5.5μg·mL-1可以实现疗效最大化、不良反应最小化，本研究测定的标本67.10%谷浓度达到该范围，对于未达标的原因还应做更进一步的探索。血液肿瘤患者免疫功能低下，病原菌及感染灶不明确，临床上通常采用经验性治疗。经验用药使患者获益的同时也存在风险，如抗感染效果欠佳，不良反应发生率升高等。因此，建议临床应结合病原学检查结果及时调整抗菌药物的使用，并根据血药浓度优化给药策略，实现精准治疗[18-20]。 [参考文献] [1]戴映，张海娜，林观样，等.伏立康唑群体药动学研究及其在给药方案设计中的应用进展[J].中国临床药理学与治疗学，2018，23（9）：1063-1067. [2]王晓晨，王思箭，刘林夕，等.伏立康唑个体化给药研究进展[J].中国抗生素杂志，2020，45（1）：16-25. [3]张寒娟，谢悦旭，任彤，等.根据治疗药物监测指导伏立康唑个体化用药的案例分析[J].药学服务与研究，2019，19（2）：129-132. [4]陈垦，张相林，克晓燕，等《伏立康唑个体化用药指南》解读.[J].临床药物治疗杂志，2019，17（3）：47-52，78. [5]曲彩红，周凤丽，黄建华，等.高效液相色谱-串联质谱法测定侵袭性真菌感染患者伏立康唑的血药浓度[J].中国医院药学杂志，2013，33（1）：19-23. [6]张志华，易鸿，何周康，等.HPLC-MS/MS法测定伏立康唑的血药浓度及其在生物等效性研究中的应用[J].中南药学，2009，7（12）：889-892. [7]杨婷，陈璐璐，胡伟，等.超高效液相色谱法测定人体血清中伏立康唑药物浓度[J].中国现代医学杂志，2016，26（19）：37-41. [8]程昱，丘宏强，阙万才，等.固相萃取-HPLC法测定人血浆中伏立康唑浓度及其临床应用[J].中国临床药理学杂志，2016，32（20）：1894-1896，1904. [9]刘香芳，滕文兵，蔡捷，等.HPLC法测伏立康唑的血药浓度[J].海峡药学，2020，32（7）：47-49. [10]丁记者，林小青，温悦，等.高效液相色谱法与酶放大免疫分析法检测人血浆中伏立康唑浓度的比较[J].中国临床药学杂志，2020，29（4）：266-271. [11]Pascual A,Calandra T,Bolay S,et al.Voriconazole therapeutic drug monitoring in patients with invasive mycoses improves efficacy and safety outcomes[J].Clin Infect Dis,2008,46(2):201-211. [12]Park WB,Kim NH,Kim KH,et al.The effect of therapeutic drug monitoring on safety and efficacy of voriconazole in invasive fungal infections:a randomized controlled trial[J].Clin Infect Dis,2012,55(8):1080-1087. [13]Racil Z,Winterova J,Kouba M,et al.Monitoring trough voriconazole plasma concentrations in haematological patients:real life multicentre experience[J].Mycoses,2012,55(6):483-492. [14]陈文瑛，黄思琪，谢白露，等.伏立康唑个体化给药研究新进展[J].中国医院药学杂志，2013，33（14）：1181-1184. [15]任秋霞，朱红，王艳红，等.2例重度肝硬化患者伏立康唑血药浓度监测与不良反应分析[J].中国药物应用与监测，2018，15（6）：381-383. [16]江灏，唐敏，李薇，等.1例伏立康唑诱发精神症状的病例分析[J].中国药物应用与监测，2020，17（2）：136-138. [17]Dolton MJ,Ray JE,Chen SC,et al.Multicenter study of voriconazole pharmacokinetics and therapeutic drug monitoring[J].Antimicrob Agents Chemother,2012,56(9):4793-4799. [18]王陶陶，胡萨萨，尤海生，等.恶性血液病患者中伏立康唑血药浓度监测及其影响因素的探讨[J].中国医院药学杂志，2018，38（7）：693-696，707. [19]鲁虹，史群志，李玲，等.基于伏立康唑血药浓度监测的药物相互作用研究[J].中国抗生素杂志，2019，44（7）：864-867. [20]张瑞霞，张艳，张弋，等.伏立康唑谷浓度在血液科患者中的分布特征及影响因素[J].中国药物应用与监测，2019，16（4）：204-207. （收稿日期：2020-09-17修回日期：2021-01-28）
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发表于 2022-11-9 09:40:43
