LC－MS／MS法同时测定干血斑中伏立康唑及其主要代谢产物...

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本研究建立了一种简单､灵敏和快速测定干血斑中伏立康唑及其主要代谢产物氮氧化伏立康唑质量浓度的 LC-MS/MS分析方法,可用于ICU 患者体内的药物动力学研究｡本研究的采血方法是非侵入性的､易于操作,采血体积小,可以替代传统的静脉穿刺采血方法｡


作者

程晓亮1,邸 莹2,张 春2,李 娜2,李 嘉璐2,张 雷1,姚 鸿萍1*

(1.西安交通大学第一附属医院药学部,西 安 710061;2.西安交通大学第一附属医院肝胆外科,西安 710061)

来源

西北药学杂志 ２０１９年９月 第３４卷 第５期605-611

摘要

目的 建立一种同时测定干血斑中伏立康唑及其主要代谢产物氮氧化伏立康唑质量浓度的 LC-MS/MS法｡

方 法 将2滴血滴在 Whatman903滤纸上制备干血斑,干血斑经甲醇萃取后直接进样分析｡色谱柱为HypersilGOLDaQ,流动相为甲醇-1 mL·L-1甲酸溶液,梯度洗脱｡正离子检测,扫描方法为选择性反应监测,伏立康唑､氮氧化伏立康唑和内标酮康唑的检测离子对分别为 m / z350.1 → 281.0,365.8 → 224.1 和531.3 → 489.2 ｡

结果 干血斑中伏立康唑和氮氧化伏立康唑的质量浓度在0.01~10.00μg·mL-1范围内线性关系良好,二者的最低定量下限为0.01μg·mL-1｡伏立康唑和氮氧化伏立康唑的日内和日间精密度均小于15%,日内和日间相对误差均在-15%~15%范围内,伏立康唑和氮氧化伏立康唑的提取回收率分别为84.65%~90.49%和85.41%~95.72%,二者无显著基质效应｡红细胞压积对二者的测定无显著影响,二者在室温下保存24h和-80℃保存1个月的条件下稳定｡该方法成功应用于伏立康唑和氮氧化伏立康唑在ICU 患者体内的药物动力学研究｡

结论 建立的 LC-MS/MS法具有采血无创伤､易于操作和仅需微量血液等优点｡

关键词

伏立康唑；氮氧化伏立康唑；ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法；干血斑；药物动力学

中图分类号

Ｒ917

文献标志码

A

文章编号

1004-2407(2019)05-0605-07

DOI

10.3969/j.issn.1004-2407.2019.05.009

伏立康唑是一种二代三唑类抗真菌药物,对曲霉菌､假丝酵母菌和镰刀菌具有广谱抗真菌作用,广泛应用于预防和治疗真菌感染[1-2];伏立康唑主 要 经 细胞色素 P450酶CYP2C19代谢,少量经 CYP3A4和CYP2C9代谢[3-4],主要代谢产物是氮氧化伏立康唑,占人体内所有代谢产物的72%[5]｡伏立康唑和氮氧化伏立康唑的化学结构见图1｡在个体间,伏立康唑具有显著的非线性药物动力学差异[6],这种差异与细胞色素 P450酶的基因多态性､药物间的相互作用和肝功等有关[7-9]｡为了研究伏立康唑和氮氧化伏立康唑的药物动力学特征,需建立一种简单､灵敏的分析方法｡

生物样品中伏立康唑质量浓度的分析可采用HPLC法[10-11]､LC-MS/MS 法[12-14]､GC-MS法[15]和免疫法[16]等,有文献报道配有紫外检测器的HPLC法[17]和 LC-MS/MS法[18]可同时分析伏立康唑和氮氧化伏立康唑｡但文献报道的分析方法需采集体积较大的血液以分离血浆,限制了其在患者(特别是儿童､老年人和ICU患者)体内的药物动力学应用研究｡干血斑法(DBS)是一种新的采血方法,仅需指尖穿刺采集约50μL血液,将血液滴在滤纸上,晾干后分析[19-20]｡与传统的静脉采血相比,干血斑法具有非侵入性采血､采血体积小以及样品保存和运输中生物危害风险低等优点[21]｡有文献报道,测定干血斑中三唑类抗真菌药物包括伏立康唑的分析方法[22],但该方法不能测定氮氧化伏立康唑｡同时测定伏立康唑和氮氧化伏立康唑具有评价药物代谢快慢[23]､快速调整用药剂量和鉴别代谢缺陷患者[24]的优点｡因此,本研究拟建立一种测定干血斑中伏立康唑和氮氧化伏立康唑质量浓度的 LC-MS/MS方法,并将该方法用于ICU患者体内的药物动力学研究｡1 仪器与试药    １.１ 仪器

Thermo TSQ Endura型三重四级杆质谱(配有可加热电喷雾离子源),Dionex Ultimate 3000型高效液相色谱仪(配有HGP-3200RS型双梯度泵､SRD-3200型真空脱气机和 CTC自动进样器)(美国Thermo公司);Basic型电子天平(德国赛多利斯集团);Allegra TM×-22R高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司);Elix@3纯水仪(美国Mili-pore公司)｡

１.２ 试药

伏立康唑对照品(批号20170314,质量分数为98%)､氮氧化伏立康唑对照品 (批号20170507,质量分数为97%)和酮康唑对照品(批 号20161129,质量分数为99%),均购自北京百灵威科技公司;甲醇为色谱纯,购自德国默克公司;超纯水为实验室自制｡

2 实验方法     ２.１ 色谱条件

分析色谱柱为 HypersilGOLDaQ(50 mm ×2.1 mm,1.9 μm);流动相为甲醇-1mL·L-1甲酸溶液;流速为0.3mL·min-1;梯度洗脱程序:0~0.5min,水相为90%;0.5~1.5min,水相降至30%并保持2 min;3.5~4 min,水相增至90%并保持1 min｡进样量为 10μL,进样后 2~4min流动相通过切换阀切换进入质谱检测,其余时间切换至废液｡为了降低残留效应,每次分析结束后用体积分数为10%和50%的甲醇清洗 CTC进样系统｡

２.２ 质谱条件

离子源为可加热电喷雾离子源(HESI),正离子监测,电喷雾电压为3500 V,离子源蒸发温度为200 ℃,离子传输管温度为320 ℃,扫描方法为选择反应监测(SRM)｡伏立康唑和氮氧化伏立康唑的分子离子峰 [M+H]+和碎片离子峰见图2｡伏立康唑､氮氧化伏立康唑和内标酮康唑的检测离子对分别为m/z350.1→281.0,365.8→224.1和531.3→489.2,套管透镜补偿电压分别为106,89和173V,碰撞能量分别为16.2,12.4和31.0V,碰撞气氩气的压力为1.5 mTorr｡鞘气 (N2)和辅助气(N2)的流速分别为35和 8Arb｡

２.３ 溶液的制备2.3.1 对照品溶液 精密称取伏立康唑和氮氧化伏立康唑对照品各10mg,分别置于10mL量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,分别配制成质量浓度为1mg·mL-1的对照品储备液｡精密吸取上述伏立康唑和氮氧化伏立康唑对照品储备液,分别用甲醇稀释成质量浓度为0.2,1.0,2.0,10.0,20.0,40.0,100.0和200.0 μg·mL-1的系列对照品溶液,置于4 ℃冰箱中保存｡将内标酮康唑溶于甲醇中,稀释成质量浓度为5μg·mL-1的内标溶液｡2.3.2 血液样品溶液和质控样品溶液的制备 取90μL空白血液8份,分别加入5μL不同质量浓度的伏立康唑和氮氧化伏立康唑对照品溶液,制备伏立康唑和氮氧化伏立康唑终质量浓度分别为0.01,0.05,0.10, 0.50,1.00,2.00,5.00和10.00μg·mL-1的血液样品溶液｡在空白血液中加入不同质量浓度的伏立康唑和氮氧化伏立康唑对照品溶液,制备伏立康唑和氮氧化伏立康唑终质量浓度分别为0.02,0.50和8.00μg·mL-1的质控样品溶液｡
２.４ 干血斑的制备和前处理

将2滴2.3.2项下制备的血液样品溶液､质控样品溶液和指尖穿刺采集的血液滴在Whatman903滤纸上,在室温下干燥3h,用打孔器在干血斑中央打1个直径为6mm 的干血片｡干血片用500μL甲醇溶液(含有0.5μg·mL-1内标溶液)萃取,振荡30min,超声1min,在4 ℃下以13000r·min-1离心15min,取10μL 上清液进样分析｡

２.５ 方法学验证2.5.1 专属性 通过对比空白干血斑､分别加入伏立康唑､氮氧化伏立康唑和内标酮康唑的空白干血斑以及给药后患者干血斑的色谱图,考察本方法的专属性｡2.5.2 最低定量下限(LLOQ) LLOQ 为标准曲线的最低定量下限｡取90μL空白血液,加入不同质量浓度的伏立康唑和氮氧化伏立康唑对照品溶液各5μL,按照2.4项下方法制备干 血斑并进行样品前处理后进样分析,当信噪比(S/N)为10时的检测质量浓度为本方法的 LLOQ｡2.5.3 标准曲线的建立 取空白血液90μL,加入不同质量浓度的伏立康唑和氮氧化伏立康唑对照品溶液各5μL,血液中伏立康唑和氮氧化伏立康唑的理论质量浓度分别为0.01,0.05,0.10,0.50,1.00,2.00,5.00和10.00μg·mL-1｡按照2.4项下方法制备干血斑并进行样品前处理后进样分析,分别以伏立康唑和氮氧化伏立康唑峰面积与酮康唑峰面积的比值对其质量浓度作图,用加权最小二乘法进行线性回归,得加权标准曲线｡2.5.4 提取回收率和基质效应实验 取空白血液90μL,加入不同质量浓度的伏立康唑和氮氧化伏立康唑对照品溶液各5μL,按 照2.4项下方法制备干血斑,将整个干血斑剪下,加入甲醇溶液萃取,进样分析得峰面积 A｡按照上述方法取空白血液制备干血斑,加入甲醇溶液萃取,上清液中加入5μL相同质量浓度的伏立康唑和氮氧化伏立康唑对照品溶液,进样分析得峰面积B｡取相同体积的甲醇溶液,加入5μL相同质量浓度的伏立康唑和氮氧化伏立康唑对照品溶液,进样分析得峰面积C｡A/B为本方法的提取回收率,B/C为本方法的基质效应｡2.5.5 精密度和稳定性实验1d内按照2.3.2项下方法平行制备伏立康唑和氮氧化伏立康唑的高､中､低质控样品各5份,进样分析,计算日内精密度RSD值和准确度(以相对误差表示)｡连续5d制备伏立康唑和氮氧化伏立康唑高､中､低质控样品,进样分析,计算日间精密度 RSD值和准确度｡2.5.6 红细胞压积效应 红细胞压积直接影响血液的黏度,从而影响血液在滤纸上的流动和扩散｡男性和女性的正常红细胞压积值分别为0.35~0.45 和0.40~0.50｡在一定体积的红细胞中加入不同体积的血浆配制红细胞压积值分别为0.25,0.40和0.50的血液,以评价红细胞压积对伏立康唑和氮氧化伏立康唑测定的影响｡用不同红细胞压积值的血液配制5份伏立康唑和氮氧化伏立康唑高､中､低质控样品,用红细胞压积为0.35的血液建立的标准曲线计算实测质量浓度｡




４ 讨 论      从伦理学考虑,禁止对ICU 患者采集体积较大的血样,干血斑法具有非侵入性采血和采血体积小等优点,本研究建立一种能同时测定干血斑中伏立康唑和氮氧化伏立康唑的 LC-MS/MS方法｡与氘带作为内标相比,酮康唑作为内标易于获得且经济,与伏立康唑和氮氧化伏立康唑相比具有相似的色谱特性､回收率和离子化性质｡采用梯度分离分析物和内源性基质,起始体积分数为10%的甲醇相保持0.5min,在1min内甲醇相逐渐增加至体积分数为70%,保持2min,因为高比例有机相的流动相可增强分析物的离子化效率[25]｡ 在干血斑分析方法的开发中,选择合适的溶剂将分析物从干血斑中有效萃取出是非常重要的,这直接影响回收率和灵敏度,也会影响精密度和准确度｡疏水性的有机试剂,如甲醇､乙腈或混合有机试剂,是简单的干血斑萃取溶剂｡这种方法可以将血液中的主要内源性物质(如蛋白和盐)保留在滤纸上,使萃取液干净,无需进一步纯化便可直接进样分析[26]｡本 研究采用甲醇或乙腈萃取干血斑,结果表明,甲醇萃取伏立康唑和氮氧化伏立康唑的回收率均大于80%,乙腈萃取的回收率和质谱信号低;甲醇萃取液可直接进样分析,无需进一步纯化处理,无明显的基质效应｡因此,选择甲醇萃取干血斑｡ 文献报道,测定干血斑中抗真菌药物的LC-MS/MS法中伏立康唑的LLOQ为0.1μg·mL -1[22],本研究建立的 LC-MS/MS法的LLOQ 为0.01μg·mL-1,灵敏度更高｡文献报道的方法采用甲醇和水萃取干血斑,流动相包括缓冲盐(含有三氟乙酸酐､乙酸和乙酸铵)､乙腈和水[22],流动相较复杂,本研究中干血斑萃取试剂和流动相都较简单｡ 本研究建立了一种简单､灵敏和快速测定干血斑中伏立康唑及其主要代谢产物氮氧化伏立康唑质量浓度的 LC-MS/MS分析方法,可用于ICU 患者体内的药物动力学研究｡本研究的采血方法是非侵入性的､易于操作,采血体积小,可以替代传统的静脉穿刺采血方法｡