高效液相二极管阵列检测法测定人血浆中伏立康唑和 N-氧...

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作者

罗兴献，黄琳，李泰锋，胡蕾，刘雪梅，薛学财，张海英，陈月，冯婉玉* ( 北京大学人民医院药剂科，北京 100044)

来源中国药学杂志2019年7月第54卷第14期 1169-1175摘要

目的：建立同时测定伏立康唑及其主要代谢物N-氧化伏立康唑血药浓度方法，并用于监测2～12岁儿童白血病 中伏立康唑和N-氧化伏立康唑的血药浓度。

方法：采用Agilent ZORBAX SB-C18柱( 4. 6mm × 250mm,5 μm) ,流动相为乙腈､甲醇与醋酸铵缓冲液(10 mmol·L-1,用醋酸调节pH值至3. 0)=27∶23∶50,流速为1mL·min -1,波长为262 nm｡以卡马西平为内标,样品处理采用乙酸乙酯液液萃取｡

结果：伏立康唑和N-氧化伏立康唑的血浆浓度在0. 1~ 8. 0μg·mL- 1内呈良好的线性,定量下限均为0. 1μg·mL - 1,批内､批间精密度( RSD)均在3% ~ 10%以内｡准确度和方法回收率均符合要求｡此次监测29例儿童白血病患者,共100 个血样｡伏立康唑浓度､N-氧化伏立康唑及 N-氧化 伏立康唑与伏立康唑的比值中位数值分别为0. 87μg·mL- 1(IQR,0.32 ~ 1.65 μg·mL- 1) ､1. 15μg·mL- 1 (IQR, 0. 55 ~ 1. 67 μg·mL - 1) 和1. 10( IQR,0.66 ~ 1. 22) ｡伏立康唑浓度与 N-氧化伏立康唑浓度存在相关性( r = 0. 6031, P < 0.0001) ｡

结论：本方法操作简单、准确、专属性高，满足临床同时监测伏立康唑和 N-氧化伏立康唑浓度，可用于伏立康唑药动学研究及临床上治疗药物监测。

关键词

伏立康唑; N-氧化伏立康唑; 高效液相二极管阵列检测; 儿童白血病; 治疗药物监测

中图分类号

R917

文献标识码

A

文章编号

1001－2494(2019)14－1169－07

DOI

10. 11669 /cpj. 2019. 14. 009

伏立康唑( voriconazole,VRCZ) 是一种广谱三唑类抗真菌药,通过抑制真菌中细胞色素P450介导的14α-甾醇去甲基化而抑制麦角甾醇的生物合成,广泛用于侵袭性曲霉菌病､非中性粒细胞减少患者中的念珠菌血症及现有抗真菌药敏感性较低的菌属等感染[1-2]｡然而,由于VRCZ在人体内代谢具有饱和性和自身剂量依赖性抑制代谢酶,其药动学呈非线 性变化,在不同的个体间和个体内呈显著的差异[3]｡有研究表明,VRCZ的稳态血药浓度与临床疗效和安全性密切相关[4-6]｡最近有相关文献推荐维持 VRCZ 稳态血药浓度范围在1~ 5. 5μg·mL-1内可显著提高临床疗效[7]｡当VRCZ稳态血药浓度浓度大于5. 5μg·mL-1时,其不良反应发生率也明显增加[8]｡因此,常规监测VRCZ稳态血药浓度具有重要的临床价值｡

VRCZ主要代谢产物为N-氧化 VRCZ ( N-oxi- dized voriconzaole,VNO) ,在血浆中约占72% ,结构 式见图1｡VNO的生成主要经过人肝脏细胞色素( CYP) 2CY19,CYP3A4及含黄素单氧化酶( flavin- containing mono-oxygenase,FMO)生成[9-10]｡有研究表明,VNO 可抑制CYP2C19和CYP3A4酶的活性, 这可能间接导致VRCZ疗效的差异[11]｡最近,有多项研究通过测定VNO生成比值( metabolic rate, MR)来研究炎症与VRCZ浓度之间的关系[12-14]｡Yan等[15]通过 MR 来评估质子泵抑制剂对伏立康唑代谢的影响｡此外,Niioka 等[16]证明 MR 还可用于评估患者CYP2C19酶的代谢类型｡因此,同时测定VRCZ和VNO 的血药浓度,可用于研究VRCZ的个体化差异机制､药物相互作用以及药物基因多态性等探讨,具有重要的临床运用价值｡

目前关于同时测定人血浆中VRCZ和VNO浓度的高效液相方法学文献报道较少[17-19]｡此次试验旨在建立简便､准确､专属 性高,能同时测定VRCZ及其主要代谢物VNO浓度的高效液相色谱法,并用于儿童白血病患者血药浓度监测,探讨儿童( 2~12岁)患者中 VRCZ､VNO的浓度及MR之间的关系等,为优化VRCZ剂量和制定VRCZ个体化 治疗提供理论依据｡

1 实验部分      1.1 仪器

高效液相色谱仪( 2695，Waters 公司) ; PDA-紫外检测器(2998，Waters 公司) ; Empower 数据处理系统( Waters 公司) ; Milli-Q Advantage A10 超纯水机。

1.2 药品与试剂

卡马西平对照品 ( 批号: 100142-201105，中国食品药品检定研究院) ; VＲCZ对照品( 批号:100862-201402，中国食品药品检定研究院) ; VNO对照品( 批号: 7-DPM-64-3，Toronto Ｒesearch Chemi- cals 公司，加拿大) 。甲醇、乙腈为色谱纯。其他试 剂均为分析纯。水为双蒸去离子纯净水。空白血浆来自健康受试者。

1.3 色谱条件

色谱柱: Agilent ZORBAX SB-C18柱(4. 6mm×250mm,5μm) ; 流动相:乙腈､甲醇与醋酸铵缓冲液(10mmol·L-1,用醋酸调节pH值至3.0) 比例为:27∶23∶50;检测波长:262nm; 流速: 1mL· min- 1 ; 柱温: 35. 0℃ ;进样量:20μL｡

1.4 混合标准储备液和内标液配制

分别称取VRCZ10 mg和VNO10 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解稀释至刻度,获得质量浓度均为1mg·mL-1混合储备液｡准确称取卡马西平10mg,并置于10mL量瓶中,同样用甲醇稀释至刻度,获得质量浓度为1mg·L-1储备液｡将VRCZ､VNO和卡马西平储备液分装成若干份,置于-80℃冷冻保存｡

1.5 标准曲线和质控样品配制

准确吸取空白血浆180μL于1.5 mL离心管 中,加入混合储备液20μL｡采用空白血浆进行等 比稀释,配制成标准曲线点为: 0. 1,0. 25,0. 5,1. 0, 2. 5,5,8 μg·mL-1｡另取180μL 空白血浆,加入适量混合储备液,配置低､中､高质控分别为0. 3,1,6 μg·mL-1｡

1.6 血浆样品处理

精密吸取血浆200μL于1. 5 mL离心管中,加入20μL内标液(卡马西平10μg·mL-1 ) ,加入1mL乙酸乙酯,涡旋5min,13400r·min-1离心5 min,取有机层900μL,氮吹10 min,流动相 100μL复溶,离心､取上清20μL进样分析｡

2 方法与结果        2.1 方法专属性

空白血浆､混合标准品及内标的空白血浆和患者服用VRCZ达稳态时血样按“1. 5”项下方法处理,结果见图2,表明血浆内源性物质不干扰待测物｡VNO,VRCZ 和内标出峰时间分别为5. 34､11. 72和7. 73min｡

2.2 标准曲线和定量限

按“1. 5”和“1. 6”项下方法处理样品和进样分析｡以VRCZ或VNO 浓度为横坐标( ρ) ,其峰面积 ( As) 与内标峰面积( Ai) 之比为纵坐标( Y) ,权重系数为1 /ρ2,进行线性回归｡结果表明,VRCZ 和 VNO在浓度 0. 1 ~ 8. 00 μg·mL-1之间呈良好的线性关 系,其线性回归方程分别为 Y = 0. 671 5ρ - 0. 090 5 ( r = 0. 992) 和Y= 1. 894 2ρ - 0. 24( r = 0. 998) ｡

2.3 准确度和精密度

分别配制VRCZ和VNO最低定量浓度( lower- limit of quantification,LLOQ) ､低､中､高质控样品,每个浓度各进行5份样品进行分析,按“1. 5”项下方 法处理,并按“1. 6”项下方法进样分析,连续测定3d,计算批间和批内变异｡结果表明,精密度和准确度均符合要求,结果表1｡

2.4 提取回收率

配制VRCZ和VNO低､中､高质控样品,每个浓 度各进行5份样品,按“1. 5”项下方法处理｡另取空白血浆,按“1. 5”项下方法处理样品,取上清液后加入内标及相同浓度的VRCZ和 VNO 低､中､高质控样品,每个浓度平行5份样品进行检测｡结果表明,低､中､高浓度的 VRCZ和VNO提取回收率均大于70% ,满足生物样本分析的要求｡

2.5 稳定性

配制VRCZ和VNO低､中､高质控样品,每个浓度平行5份,-80℃冻存28d､反复冻融3次､4 ℃保存7d情况下稳定( RSD<9%) ｡配制混合标准 储备液和内标各5份,室温放置5和24h,结果表明,VRCZ浓度稳定( RSD<5% ) ｡而VNO室温放置5 h稳定,但24 h后低､中､高VNO浓度降解均超过20% ｡

2.6 药物干扰性实验

患者服用VRCZ常与其他药物合用,包括质子泵抑制剂,抗菌类药物､免疫抑制剂等药物,可能对VRCZ和VNO产生干扰｡因此,此次实验考察了相关药物对VRCZ及VNO测定的影响,具体药物见表2｡配制适当的浓度,按“1. 6”项下方法处理血浆样品,按“1. 3”项下色谱条件进样分析｡结果表明,这些药物尚未观察到对VRCZ和VNO产生干扰｡

2.7 临床运用

本试验通过北京大学人民医院伦理委员会审 批,所有儿童患者于实验前签署知情同意书｡此次纳入患者的标准为:①2 ~ 12 岁儿童白血病患者; ②患者以4 mg·kg- 1或6mg·kg - 1口服或注射伏立康唑10次后采集患者晨起空腹血,血药浓度已达稳态血药浓度[20]｡收集患者静脉血2~3mL于含EDTA的离心管,3500 r·min-1离心10min后,收集上清液,并保存于- 20℃待测｡

结果纳入29例儿童患者,共监测100例次｡所有患者均合用免疫制剂环孢素｡有部分患者合用糖皮质激素(18 /29)和泮托拉唑( 6 /29) ,信息见表3｡测定结果表明,VRCZ浓度呈明显差异,数值为小于0. 1~14. 46μg·mL - 1之间(中位数浓度:0. 87μg· mL - 1 ; 平均浓度: 1. 63μg·mL- 1 ; 四分位距: 0. 32~ 1. 65μg·mL- 1 ) ,其代谢物VNO浓度在0. 1~ 4. 98μg·mL- 1之间(中位数浓度: 1. 15μg·mL - 1;平均浓度: 1.18μg·mL - 1 ;四分位距:0. 55~ 1. 67μg·mL - 1 )｡由VRCZ与VNO的比值可得MR值在0. 03 ~ 5. 73之间(平均值: 1. 62; 中位数: 1. 10; 四分位距:0.66~2.22)｡此次监测的血样中共有38例次的VRCZ稳态血药浓度达到1~5. 5μg·mL-1,约占38%,其MR值中位数为0.99｡有63%的血样VRCZ浓度小于1 μg·mL- 1,测得 MR中位数值为1. 90｡还有7个血样VRCZ浓度超过5. 5μg·mL - 1, 其MR中位数值为0. 30｡MR值在VRCZ不同浓度范围内呈显著差异,见图3｡VNO浓度与VRCZ的浓度呈一定的相关性(r=0. 61,P<0.0001) ,见图4｡

2.8 统计分析

采用SPSS20. 0对VRCZ与VNO进行Spearman相关性分析｡根据VRCZ稳态谷浓度,将 VRCZ分成3组,分别为低浓度组(<1μg·mL - 1,L组) ､中浓度组( 1~ 5. 5μg·mL - 1,M组)和高 浓度组(>5. 5μg·mL- 1,H组) ｡通过Mann-Whitney U检验来比较各组中的MR值有无统 计学差异｡ P<0. 05表明具有统计学意义｡