反相高效液相色谱法同时测定伊马替尼及伏立康唑血药浓度

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作者

罗兴献1,2,黄琳1,李泰锋1,薛学财1,2,王宇航1,陈月1,杨长青2,冯婉玉1 (1.北京大学人民医院药剂科,北京100044;2.中国药科大学基础医学与临床药学学院,江苏 南京211198)

来源

中国医院药学杂志2018年１月第38卷第１期  36-40

摘要

目的:建立同时测定人血浆中伊马替尼及伏立康唑浓度的高效液相色谱法｡

方法:血桨样品经乙酸乙酯-正己烷(75∶25)萃取,选择卡马西平为内标,氮吹浓缩､复溶后采用HPLC分 析｡ZORBAXSB-C18柱反相柱(250mm×4.6mm,5μm)为色谱柱,流动相为甲醇-乙腈-醋酸铵缓冲液(25mmol·L-1CH3COONH4,CH3COOH调pH值至4.5)=20∶32∶48(V/V/V),检测波长264nm,流速为1mL·min-1,柱温35℃,进样量为20μL｡

结果:伊马替尼､伏立康唑血药浓度线性范围分别为0.10~5.00μg·mL-1和0.10 ~6.00μg·mL-1,两者的线性均良好(r分别为0.998和0.999),最低定量下限均为0.10μg·mL-1｡伊马替尼和伏立康唑低､中､高质量浓度的提取回收率分别为69.21%,71.23%,73.53%和76.23%, 78.12%, 79.34%, 二者批内RSD均小于15%｡

结论:该方法简便､快速､灵敏度高可满足同时检测伊马替尼和伏立康唑的临床血药浓度监测及药动学研究｡

关键词

高效液相色谱法；伊马替尼；伏立康唑；血药浓度监测

中图分类号

R927

文献标识码

Ａ

文章编号

1001-5213(2018)01-0036-05

ＤＯＩ

10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2018.01.09

伊马替尼是第一代小分子酪氨酸激酶抑制剂,选择性作用于Bcr-ABL､血小板衍生化 生长因子(PDGF)､干细胞因子(SCF)及 C-KIT 受体,常用于慢性白血病 (CML)和胃肠间质肿瘤 (GIST)的治疗[1]｡大部分患者使用伊马替尼后症状均可缓解,然而有10%~15%患者对伊马替尼产生耐药,导致治疗失败｡伊马替尼耐药的原因可能与Bcr-ABL基因突变､SRC基因过度表达､CYP3A4酶多态性､药物转运体P-糖蛋白 (P-gp)及乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等密切相关[2]｡最近多项研究表明伊马替尼血药谷浓度维持在1000ng·mL-1以上有助于提高慢性白血病患者的疗效[3-4]｡

伊马替尼主要经CYP3A4及CYP3A5代谢,其余部分通过CYP1A1､CY1B1､CYP2C8及CAP2D6代谢[1,5-6]｡有研究表明 CYP3A4抑制剂或诱导剂药物与伊马替尼合用时可显著改变伊马替尼浓度[7-9],其中包括三唑类抗真菌药｡Dutreix等[7]报道称酮康唑可显著增加伊马替尼浓度约为40%,其机制可能是酮康唑抑制CYP3A4活性｡伏立康唑作新型三唑类抗真菌药,同样对CYP3A4有不同程度的抑制作用[10]｡同时,伏立康唑在体内呈非线性药动学代谢,其安全性和有效性也与血药浓度存在密切关系｡最 近,一项Meta分析表明伏立康唑大于3μg·mL-1时可显著增加毒性,尤其对亚洲人群[11]｡以往有研究报道称1例慢性髓系白血病患者同时服用伊马替尼和伏立康唑后致严重皮肤毒性反应,测得患者的伊马替尼血药浓度远高于理论预测值,推测其可能原因是伏 立康唑通过抑制CYP3A4酶而导致伊马替尼血药浓度显著增加[12]｡因此,同时检测伊马替尼和伏立康唑血药浓度有重要的临床价值,有助于减少药物不良反应､药物潜在相互作用以及提高药物疗效｡目前,虽然国内外均有报道单独检测伊马替尼[13-14]或伏立康唑[15-16]方法学,但尚未报道同时检测伏立康唑和伊马替尼血药浓度的方法｡本实验采用反相高效液相方法同时测定伊马替尼和伏立康唑血药浓度｡

１ 材料      

高效液相色谱仪(Waters2695)｡伊马替尼标准品(SellectchemicalsLLC,批号:S247512,纯度大于99%);伏立康唑标准品(批号100862-201402,纯度大于99%);卡马西平标准品 (批号 100142-201105,纯度为99.7%)中国食品药品检定研究院;甲醇(Fisher,色谱纯);乙腈(Fisher,色谱纯);水 为双蒸去离子纯净水｡空白血浆来自健康受试者｡

２ 方法与结果        2.1 色谱条件

色谱柱为AgilentZORBAXSB-C18柱(250mm ×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-乙腈-25mmol·L-1醋酸铵缓冲液(用醋酸调节pH值至4.50),其比例为20∶32∶48,检测波长为264nm,柱温为35.0 ℃,流速为1mL·min-1,进样量为20μL｡

2.2  储备液配制

2.2.1 对照品溶液精密称取伏立康唑对照 品10.24mg,伊马替尼对照品5.32 mg,分别置于10mL量瓶中,用甲醇溶解伏立康唑和伊马替尼后分别稀释至刻度,摇匀即得伏立康唑质量浓度为1.02mg·mL-1,伊马替尼质量浓度为0.53 mg·mL-1｡将上述储备液于-20 ℃冰箱保存｡

2.2.2 内标溶液 精密称取卡马西平对照品19.21mg,置于100mL量瓶,用甲醇溶解并稀释至刻度,得质量浓度为0.19mg·mL-1,并 于-20 ℃冰箱保存｡

2.3  血清样品处理

取血浆样本0.2mL于1.5mL离心管中,加入10μg·mL-1内标液20μL,加入1 mol·L-1NaOH 100μL,涡旋混匀后,加1mL有机溶剂 (乙酸乙酯-正己烷 =75∶25)提取 5min,13000r·min-1离心10min,转移上层有机相0.9mL于1.5mL离心管中,常温下氮气吹干,100μL流动相复溶,涡旋,离心,取20μL上清进样分析｡

2.4  方法专属性

取空白血浆,空白血浆加入对照品溶液和内标溶液,患者同时以4mg·m-2口服伏立康唑13d和340mg·m-2口服伊马替尼24d后采集的血样,按照“2.3”项下方法处理和进样分析,分别得到色谱图1A､图1B和图1C｡结果表明,伊马替尼､伏立康唑及内标峰形良好,分离完全,其保留时间分别4.852､9.288､6.721min,且不受血清中内源性物质干扰｡

2.5  标准曲线及定量下限

取空白血浆200μL,分别加入对应不同质量浓度的伊马替尼和伏立康唑各20μL,使伊马替尼的终质量浓度分别为0.10,0.25,0.50,1.00,2.00,4.00,5.00μg·mL-1和伏立康唑终质量浓度为0.10,0.25,0.50,1.00,2.00, 4.00,6.00μg·mL-1,按照 “2.3”项下处理并按“2.1”项下进样分析｡以伊马替尼或伏立康唑的浓度为横坐标(X),对应的峰面积(As)与内标峰面积(Ai)之比为纵坐标(Y)绘制标准曲线,计算得伊马替尼回归方程为:Y =0.8074X -0.0869(R=0.998),伏立康唑回归方程为:Y =0.8324X +0.1821(R=0.999),结果表明伊马替尼在0.10~5.00μg·mL-1与伏立康唑在0.10~6.00μg·mL-1范围内呈良好的线性关系｡两者定量下限均为0.10μg·mL-1(n =5,RSD<15%)｡

2.6  精密度与准确度

取0.2mL含不同质量浓度的伊马替尼和伏立康唑的血浆于1.5mL离心管,调整伊马替尼的终质量浓度分别 为0.20,1.00,4.00μg·mL-1,伏立康唑的终质量浓度分别为0.25,2.00 ,5.00μg·mL-1,每个浓度制备5个血浆样品,按“2.3”项下处理血浆样品,连续3d进样分析,代入当日标准曲线计算批内､批间精密度和准确度,结果见表1和表2｡由表中结果可知,低､中､高 的 血浆伊马替尼精密度分别为13.21%､8.23%､6.11%,低､中､高的伏立康唑血浆样品的精密度分别为11.91%, 9.12%,4.23%;低､中､高的血浆伊马替尼和伏立康唑的准确度均小于15%｡该结果说明本实验建立方法满足伊马替尼和伏立康唑血药浓度检测的要求｡

2.7  回收率

按“2.5”项下方法分别制备伊马替尼(0.20, 1.00,4.00μg·mL-1 )和伏立康唑 (0.20, 2.00, 5.00μg·mL-1)低､中､高质量浓度的质控样品各5份,按照“2.3”项下处理,测得的伊马替尼与伏立康唑低､中､高质量浓度峰面积分别代入其标准曲线,将计算的浓度与理论浓度进行对比,计算方法学回收率｡同法配制上述3个质量浓度血浆样品各5份,按“2.3”项下血浆处理,测得的伊马替尼与伏立康唑低､中､高质量浓度峰面积与相同浓度对照品未经液液萃取的色谱峰面积之比为提取回收率｡结果表明伊马替尼和伏立康唑方法学回收率分别在92.12%~97.36%和93.32%~96.52%之间;伊马替尼和伏立康唑提取回收率 分别在69.21% ~73.53%和76.23%~79.34%之间;内标提取回收率为81.24%,详见表3｡

2.8  样品稳定性实验

按“2.5”项下方法分别制备伊马替尼 (0.25, 1.00,400μg·mL-1)和伏立康唑(0.25, 2.00, 5.00μg·mL-1)低､中､高质量浓度的质控样品各3份,考察其血样样品处理后室温放置6h､12h,4 ℃冰箱放置3d､-20 ℃冷冻保存1个月､反复冻融等不同条件下的稳定性｡结果表明伊马替尼和伏立康唑血清样品在上述条件下测得的浓度与理论值的偏差均小于10%｡

2.9  临床运用

伊马替尼在人体内半衰期约为18h,其达峰时间为1.8~4h,口服7d后即可达稳态血药浓度[1,17]｡而伏立康唑半衰期约为 6h,研究表明以多剂量口服伏立康唑5~7d或 首剂加倍静脉给药24h内即可达稳态血药浓度[18]｡本次研究纳入的白血病患者均为同时服用伊马替尼及伏立康唑且至少连续服用1周后采集晨起空腹血样,测得伏立康唑的谷浓度范围为0.28~ 2.71μg·mL-1,伊马替尼的谷浓度为0.79~ 2.29μg·mL-1,见表4｡

   3   讨论   3.1  检测波长的选择

伊马替尼､伏立康唑以及内标卡马西平结构中都有苯环,紫外吸收明显｡采用二极管阵列检测器(PDA)检测器,对伊马替尼和伏立康唑对照品溶液190~400nm波长范围内进行全扫描,发现伊马替尼分别在238nm和266nm有最大吸收峰,伏立康唑 256nm 处有最大吸收峰｡为避免血源性物质干扰且伊马替尼和伏立康唑均有较高的吸收值,故本实验选择最佳检测波长为264nm｡

3.2  样本处理方法的选择

在本实验过程中,曾采用甲醇､乙腈､0.1%高氯酸沉淀蛋白法,但其沉淀效果并不理想,不能满足定量下限要求,也容易受到血浆内源性物质的干扰｡因液-液萃取方式相对蛋白沉淀方法能去除更多干扰物质,实验尝试用乙酸乙酯萃取｡结果表明,采用乙酸乙酯萃取虽可消除血浆内源性物质的干扰,但样品提取回收率相对较低以及萃取离心过程中容易出现乳化现象｡后改用乙酸乙酯-正己烷(75∶25)有机相进行液-液萃取,尝试在碱性条件下萃取,结果表明伊马替尼､伏立康唑和内标回收率明显增加并且没有乳化现象的发生｡

3.3  流动相的选择

据相关文献报道,测定伊马替尼或伏立康唑液相色谱方法中,流动相有乙腈-甲醇-磷酸盐缓冲液[15],乙 腈-水[16],甲 醇-乙腈-三乙胺-磷酸氢二铵[14],乙腈-0.1%三氟乙酸-水[19]等,本文最终采取醋酸铵缓冲液-甲醇-乙腈,与使用含有磷酸钾缓冲液相比,能减少对色谱仪器的损害以及保留时间变化｡本实验曾尝试分别调节醋酸铵缓冲液的pH值为3.5,4.5,5.5｡结果表明,虽然伊马替尼和伏立康唑随着酸性增强保留时间缩短,但 pH为3.5时伊马替尼在4min左右出峰,容易受内源性物质干扰｡因此最终选择pH 值为4.5醋酸铵缓冲液-乙腈-甲醇为流动相,具有较好的分离效果,临床上可同时满足伏立康唑和伊马替尼血药浓度的检测要求｡

3.4  内标的选择

本实验考察了达沙替尼、苯妥英钠、苯海拉明、卡马西平和酮康唑５种物质为内标。结果表明苯 妥 英 钠、苯 海 拉 明 时 间 大 于１５ｍｉｎ，不利于临床上快速检测；酮康唑出现拖尾；卡马西平和达沙替尼在上述液相色谱条件下均可获得合适的保留时间和较好的峰形，但考虑到价格较为昂贵，故实验最终采用卡马西平为内标。

本实验采用的反相高效液相色谱法同时检测人血浆中伊马替尼和伏立康唑，具有测定时间较短、成本低廉、专属性好等特点，适用于临床上伊马替尼和伏立康唑血药浓度监测及药动学的研究。