在线固相萃取_高效液相色谱法测定人血浆中伏立康唑浓度

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原文献阅读

作者   李 强1，2 ，邓艳辉1，2 ，段萍萍1，2 ， 朱芮芮1，2 ，陈文瑛1，2 ( 1. 南方医科大学 第三附属医院 药学部，广东 广州 510630; 2. 广东省骨与关节退行性疾病重 点实验室，广东 广州 510630)

摘要:

目的

建立一种全自动、快速、准确地测定人血浆中伏立康唑浓度的方法。

方法

采用双三元液相色谱系统串联荧光检测器，以酮康唑为内标，使用Capcell MF Ph － 1 柱作为在线固相萃取柱，Hypersil GOLD C18 柱 作 为 分 析 柱。 荧光检测激发波长为 254 nm，发射波长为 372 nm，柱温为 40 ℃，进样体积为 50 μL。考察该方法的专属性、标准曲线与定量下限、精密度与回收率、稳定性。

结果

伏立康唑在 0. 16 ～ 10. 20 mg·L － 1范围内线性良好，r = 0. 999 9。伏立康唑的平均提取回收率为 84. 38% ～ 99. 48% ，日内精密度 ＲSD ＜ 3. 26% ，日间精密 度 ＲSD ＜ 6. 11% 。

结论

本方法准确、重现性好、简化了样品前处理步骤，提高 分析效率，适用于伏立康唑血药浓度监测。

关键词: 伏立康唑; 在线固相萃取; 高效液相色谱; 荧光检测; 血药浓度

DOI: 10. 13699 /j. cnki. 1001 － 6821. 2019. 24. 016

中图分类号: Ｒ97

文献标志码: A

文章编号: 1001 － 6821( 2019) 24 － 3234 － 03

伏立康唑( voriconazole，Vor) 常用于治疗侵袭性真菌感染［1］，因 其血药浓度个体差异大［2］，临床常对伏立康唑的血药浓度进行监测［3］。随着采用在线固相萃取技术的双三元液相系统的普及，有必要建立基于双三元液相系统的检测方法。因此，本研究基于双三元液相系统，建立一种全自动、快速、准确地测定人血浆中伏立康唑浓度的方法，可用于伏立康唑的治疗药物监测( therapeutic drug monitoring，TDM) 。

材料与方法

1 药品与仪器

伏 立 康 唑 标 准 品，纯 度: HPLC ＞ 99% ，批 号: J1211AS; 酮康唑标准品，纯 度: HPLC ＞ 98% ，批 号: J0620AS，均购自大连美仑生物技术有限公司。

Ultimate 3000 双三元高效液相色谱系统配置荧 光检测器，美国赛默飞世尔科技公司产品。

2 色谱条件

色谱柱: Capcell MF Ph － 1 柱( 4. 0 mm × 20 mm，5 μm) ，为固相萃取柱; Hypersil GOLD C18柱( 4. 6 mm × 150 mm，3 μm) ，为分析柱; 流动相: 在线固相萃取柱 以乙腈 － 水( 8∶ 92) ，分析柱以乙腈 － 10 mmol·L － 1乙 酸铵溶液( 42 ∶ 58) 作为流动相; 柱温: 40 ℃ ; 流速: 1 mL·min－1。采用梯度洗脱，梯度程序及阀切换时 间，见表 1; 检测波长( λEx /λEm) : 254 /372 nm。进样 量: 50 μL; 内标: 3. 1 mg·L－1酮康唑。

3 溶液配制

伏立康唑储备液( 10. 20 mg·mL －1，甲醇配制) ， 采用甲醇稀释 100 倍，得 102. 00 mg·L － 1，然后等倍稀释 分 别 得 51. 00，25. 50，12. 75，6. 38，3. 19，1. 59 mg·L － 1标准品溶液。

4 样品处理方法

取混合空白血清及待测血浆各 100 μL，分别放入 1. 5 mL EP 管中，分别依次加入酮康唑内标液 10 μL， 空白血浆管内加入伏立康唑标准液 10 μL，待测血浆样品加入 10 μL 甲醇，然后依次加入 150 μL 甲醇沉淀蛋白。将 EP 管在涡旋仪中涡旋 3 min，然 后 以 1. 2 × 104 r·min － 1离心 10 min，取上清液 50 μL，进样分析。

5 方法学考察

专属性分别取空白血浆、空白血浆添加伏立康唑对照品和酮康唑和服用伏立康唑的病人血浆添加 IS 三种样品按“样品处理方法”项下方法处理后进样。

标准曲线与定量下限取 EP 管，分别加入空白血浆 100 μL，然后取配好系列浓度的伏立康唑对照品溶液各 10 μL，得到伏立康唑浓度分别为 0. 16，0. 32， 0. 64，1. 28，2. 55，5. 10 和 10. 20 mg·L － 1的血浆样品， 将此样品依照“样品处理方法”项下处理后进样。

精密度与回收率 在同一天内，用空白血浆与伏立康唑对照品溶液配制浓度分别为 0. 32，5. 10，7. 65 mg·L － 1的样品各 5 份，按“样品处理方法”项下方法操作，进样分析，计算均值，标准差及相对标准差，得日内精密度。日间精密度同法配制浓度分别为 0. 32， 5. 10，7. 65 mg·L － 1的血浆样品，依照上述方法测定， 连续测定 3 天，同法计算。将伏立康唑对照品储备液，稀释后制成浓度为 0. 32，5. 10，7. 65 mg·L － 1的样本各 5 份，按“样品处理方法”项下同法处理后进样， 以测得值与实际值作比计算方法回收率即准确度。

提取回收率 用空白血浆/灭菌注射用水和伏立康唑对照品溶液制成浓度为 0. 32，5. 10，7. 65 mg·L － 1的样本各 3 份，按“样品处理方法”项下处理进样分析，计算提取回收率。

稳定性配制 0. 32 和 7. 65 mg·L － 1的低和高浓度的血浆样品，－ 20 ℃ 放置 24 h 后冻融 3 次、室温 ( 约 25 ℃ ) 放置 4 h 后，按“样品处理方法”项下方法操作，考察其稳定性。

结 果

1 方法学评价

专属性伏立康唑和酮康唑的保留时间分别为 6. 2 min 和 14. 0 min，其色谱峰峰形良好，完全分离， 空白血浆在伏立康唑和酮康唑出峰处无杂质峰干扰。 见图 1。

标准曲线与定量下限血浆中测定伏立康唑的 标准曲线为 y = 0. 42x － 2. 76 × 10 － 2 ( r = 0. 999 9) 。伏立康唑在 0. 16 ～ 10. 20 mg·L － 1范围时呈良好的线性 关系，定量下限为 0. 08 mg·L － 1 ( 信噪比为 10) 。

精密度与回收率 计算低、中、高 3 个浓度伏立康唑缓冲溶液样品和血浆溶液样品中伏立康唑与内 标的峰面积比值，每个浓度测定 3 次平均提取回收率 为 104. 02% ± 6. 79% 。伏立康唑低、中、高 3 个浓度 血浆质控样品的日内和日间精密度和准确度的结果， 见表 2。日内精密度( ＲSD) 介于 1. 94% 至 3. 26% 之 间。日间精度( ＲSD) 介于 3. 56% 至 6. 11% 之间。准 确度范围从 84. 38% 到 99. 48% 。精密度和准确度都 在可接受的范围内。

稳定性 低、高 2 种浓度的血浆质控样品，3 次 冻融后的样品回收率为 89. 16% ～ 91. 09% ，常温放置4 h 后样品回收率为 95. 34% ～ 100. 99%。血浆样品经室温放置4 h，反复冻融3 次均稳定，ＲSD 均小于15%。

2 方法学验证

用本研究建立的方法为 11 例真菌感染患者进行伏立康唑 血 药 浓 度 监 测 ( 伏 立 康 唑 分 散 片，每 次 100 ～ 200 mg，bid，连续给药至少 3 d) ，其中 5 例男性， 6 例女性，平均年龄为( 62. 45 ± 18. 28) 岁。测得给药 前谷 浓 度 ( 给 药 前 30 ～ 60 min 采 血 ) 范 围 为 1. 03 ～ 7. 78 mg · L － 1，处 于 治 疗 窗 ( 0. 5 ～ 5. 0 mg·L － 1［3］) 的样品比例为 75% ，而高于 5. 0 mg·L － 1的样品比例为 25. 00% ，与之前报道超治疗窗的样本 比例一致［4］。27. 27% ( 3 例/11 例) 的患者伏立康唑浓度不在此推荐范围内，可依据伏立康唑浓度及患者 的病情进行剂量调整。

讨 论

本研究用在线固相萃取仅需甲醇沉淀蛋白后直接进样，避免了柱前繁琐的分离提取过程，大大缩短 了分析时间，还可以较好地排除荧光检测有干扰的杂质峰和降低背景荧光。方法学验证结果证明此方法准确稳定，重现性好，只需少量血浆( 100 mL) ，标本采 集后 2 ～ 3 h 即可获得药物浓度测定结果，固相萃取柱 可重复使用，具有分析成本不高、灵敏度高等优点。 本研究显示伏立康唑谷浓度水平的变异性大，应在接 受伏立康唑治疗的患者中进行治疗药物监测。

参考文献:

［1］ JOB K M，OLSON J，STOCKMANN C，et al. Pharmacodynamic studies of voriconazole: informing the clinical management of invasive fungal infections［J］. Expert Ｒev Anti Infect Ther，2016，14( 8) : 731 － 746.

［2］ SHI C，XIAO Y，MAO Y，et al. Voriconazole: a review of population pharmacokinetic analyses［J］. Clin Pharmacokinet，2019，58 ( 6) : 687 － 703.

［3］ CHEN K，ZHANG X，KE X，et al. Individualized medication of voriconazole: a practice guideline of the division of therapeutic drug monitoring，chinese pharmacological society［J］. Ther Drug Monit， 2018，40( 6) : 663 － 674.

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