伏立康唑细菌内毒素检查法研究

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伏立康唑(Voriconazole，VＲC)是第二代三唑类广谱抗真菌药物，对侵袭性曲霉菌、念珠菌、足放线病菌属和镰刀菌属等真菌具有良好的抑制作用〔1-3〕。《中国药典》2015年版中未规定VＲC细菌内毒素限值，为提高VＲC质量标准，本文对VＲC采用细菌内毒素检查法的可行性进行研究，并确定其合理的内毒素限值。

1 实验材料

1.1 试剂与药品

鲎试剂1(TAL1，福州新北生化工业有限公司，批号:17062312，灵敏度:0.25EU·mL－1);鲎试剂2(TAL2，湛江安度斯生物有限公司，批号:1707122，灵敏度:0.25EU·mL－1);细菌内毒素工作标准品(中国食品药品检定研究院，批号:150800-201601，规格:9000EU/支);细菌内毒素检查用水(BET水，福州新北生化工业有限公司，批号:15090605，规格:5mL/支;湛江安度斯生物有限公司，批号:1508240，规格:5mL/支)。

1.2 样品

VＲC(由企业提供，批号VZ0010117、VZ0100417、VZ0200717)。

2 方法与结果

2.1供试品细菌内毒素限值的确定

VＲC静脉滴注每小时最大给药剂量为3mg/(kg·h)，可计算出内毒素限值为1.67EU·mg－1。本品企业标准中的内毒素限值为0.2EU·mg－1，参考了欧洲药典EP 9.0的标准〔4〕。按从严制定原则〔5〕，拟定限值为VＲC含内毒素的量应小于0.2EU·mg－1。

2.2 鲎试剂灵敏度复核

按《中国药典》2015年版四部1143细菌内毒素检查法的要求对所用鲎试剂进行灵敏度复核〔6〕(见表1)。由结果可知，所用2家鲎试剂灵敏度测定值均在0.5～2λ范围内，符合规定。

2.3 干扰试验预试验

根据最大有效稀释倍数(MVD)公式(MVD=CL/λ，其中C为10mg·mL－1，L为内毒素限值0.2EU·mg－1)及市售鲎试剂灵敏度λ现状，计算得VＲC的MVD0.5～0.03=4～66.7倍。各取3批VＲC 100mg用BET水制成10mg·mL－1溶液，再将其依次稀释成64，32，16，8，4倍(即稀释浓度分别为0.156，0.312，0.625，1.25，2.5mg·mL－1)，制成系列供试液NPC;用上述系列供试液将细菌内毒素工作标准品制成2λ浓度的供试品阳性系列溶液PPC。取灵敏度为0.25EU·mL－1的2个厂家鲎试剂分别对上述系列溶液NPC和PPC进行反应，每个浓度平行2支，另取2支加入BET水作为阴性对照，2支加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照(见表2)。

结果表明，该品种的最小无干扰稀释倍数为4倍(最大稀释浓度为2.5mg·mL－1)，即VＲC在稀释4倍及更大倍数时对鲎试剂的凝聚反应无干扰作用。

2.4 正式干扰试验

根据预实验结果，将3批供试品用BET水稀释至1.25mg·mL－1，与灵敏度为0.25EU·mL－1的2个厂家鲎试剂进行干扰试验(见表3)。结果表明，VＲC稀释至1.25mg·mL－1不干扰鲎试剂与细菌内毒素的反应，因此可使用灵敏度为0.25EU·mL－1及以上鲎试剂进行供试品细菌内毒素检查。

2.5 质量标准起草

取本品，用BET水溶解并稀释成每1mL中含VＲC≤10mg的溶液，依法检查(《中国药典》2015年版四部通则1143)测定，每1mg VＲC中含内毒素的量应小于0.2EU。

2.6 样品细菌内毒素检查

按照“2.5”项下所起草的标准，取3批样品分别用BET水溶解并稀释1.25mg·mL－1供试品溶液，以灵敏度为0.25EU·mL－1的鲎试剂TAL2依法进行常规检验(见表4)。结果表明，3批样品细菌内毒素检查均符合本文起草的质量标准要求。

3 讨论

细菌内毒素检查法相对于家兔热原检查法，具有灵敏度高、检测周期短、重复性好、结果准确等优点，且契合实验动物伦理福利的替代原则。本研究按照《中国药典》2015年版要求对样品进行细菌内毒素检查法(凝胶法)方法学研究，探讨细菌内毒素检查法检测VＲC中致热物质的可行性。

关于VＲC细菌内毒素的研究工作已有相关文献报道〔7〕，本试验将VＲC的限值从文献资料的0.75EU·mg－1提高到0.2EU·mg－1，不干扰浓度从0.67mg·mL－1提高到1.25mg·mL－1提高了VＲC安全性检查标准，并为该品种在新版国标中的修订提供科学参考和有力资料。

参考文献

〔1〕张娟，廖银根.伏立康唑的抗真菌机制与治疗药物监测进展〔J〕.中国药房，2012，23(14):1322-1324.

〔2〕Johnson LB，Kauffman CA.Voriconazole:a new triazole antifungal agen〔t J〕.Clin Infect Dis，2003，36(5):630-637.

〔3〕Miyakis S，Van Hal SJ，Ｒay J，et al.Voriconazole concentrations and outcome of invasive fungal infections〔J〕.ClinMicrobiol Infect，2010，16(7):927-933.

〔4〕EP〔S〕.9.0:3923.

〔5〕祝清芬，魏霞.药品细菌内毒素检查法质量标准研究存在问题及对策〔J〕.食品与药品，2017，19(4):287-291.

〔6〕国家药典委员会编.中国药典(2015年版四部)〔S〕.北京:中国医药科技出版社，2015，154-157.

〔7〕王红平，黄梅梅，宋祖元.注射用伏立康唑细菌内毒素检查方法研究〔J〕.现代医药卫生，2017，33(13):1948-1950.